Müsküler distrofinin tedavisi için kök hücreler – Neredeyiz?
.
Jinhong Meng, Francesco Muntoni, Jennifer E. Morgan
1 Haziran 2010'da alındı, revizyonu 13 Eylül 2010'da alındı, 8 Ekim 2010'da kabul edildi.
.
Özet
Müsküler distrofiler, ilerleyen kas kaybı ve kas zayıflaması özelliklerini taşıyan irsi bozukluklardır. Müsküler distrofilerin tedavisi için, kök hücre tedavisi en fazla ümit veren stratejilerden biridir. Elimizdeki incelemede, ilk olarak bir kök hücrenin müsküler distrofi tedavisinde kullanılabileceğine dair kanıtları inceleyeceğiz; daha sonra ideal bir kök hücrenin karşılaması gereken kriterleri tartışacağız. Ayrıca, belirli kök hücrelerinin sürekli ve faydalı bir şekilde yeniden üretilebilmelerinin sağlanması için takip edilmesi gereken standart operasyon prosedürlerinin önemini vurgulayacağız. Şu sıralarda bilimsel topluluk müsküler distrofilerin tedavisi için ideal bir kök hücre ararken, bu alanda terapatik kök hücre uygulamalarından fayda sağlanabilmesi için ilave ve itinalı araştırmaların gerekli olduğu açıkça görülmektedir.
.
1. Kök hücreler ve iskelet kasları
Bir kök hücre, kendisini yenileyebilen ve bir veya daha fazla hücre tipine ayrılabilen bir hücre olarak tanımlanmaktadır. Bir kök hücre (i) pluripotent olabilir, endodermal, ektpdermal ve mesodermal silsile, yani embriyon kök hücresi oluşturabilir; (ii) multipotent olabilir, belirli bir silsile içindeki tüm hücreleri oluşturabilir, yani hematopoietik kök hücre ve nöral kök hücre; (iii) unipotent olabilir, sadece tek tip kök hücresi oluşturabilir, örneğin keratinosit.
.
Geniş anlamda post-mitotik bir doku olan iskelet kası, büyüyebilir, kendini tamir edebilir ve yenileyebilir. Bu uydu hücreler sayesinde olur, ki bunların en azından bazıları, kas liflerini yeniden üretebilen ve uydu hücre havuzunu fonksiyonel uydu hücreler ile yeniden oluşturabilen kas kök hücreleridir. Uydu hücreler, kas liflerinin bazal tabakalarının altında bulunan pasif hücrelerdir, ki bunlar bir kuşak kas öncül hücresi, veya miyoblast, havuzu oluşturmak üzere harekete geçirilebilir. Miyoblastlar, doku kültürüne yaydırılarak doğrudan yapılan intra-müsküler transplantasyon sonrası oluşan sınırlı kas rejenerasyonuna katkıda bulunulabilir.
.
2. Müsküler distrofiler için kök hücre tedavisi
Konsept olarak düşünüldüğünde, kök hücre tedavisi resesif müsküler distrofileri için ideal bir tedavi olmalıdır, çünkü bu durumda kas lifleri genetik mutasyon sonucu kaybolmaktadır. Müsküler distrofilerin çoğunlunun nedeni, distrofin-glükoprotein kompleksi (DGC), veya laminin 2 ve kollagen VI gibi ekstraselüler matriks, veya lamin A/C veya emerin gibi nükleer zar, gibi kas kök hücresi ile bağlantılı proteinlerin genetik kodlandırılmalarındaki mutasyondur. Bu proteinlerin olmaması, örneğin DMD'de distrofin, mekanik kırılganlığa ve kas liflerinin kısalma sonucu tahrip olmasına neden olur; bunun sonucunda yangısal hücreler kasın içine süzülür ve kas rejenerasyonuna dahil olan uydu hücreler aktive olur. Distrofik kasın belirgin bir özelliği, kas lifinin dejenerasyon ve rejenerasyon devreleridir; bu devreler, hastalığın son aşamasında endojen uydu hücre havuzunun tükenerek kas liflerinin yerine fibrotik ve adipöz dokuların gelmesi ve normal kas fonksiyonunun tehlikeye atılmasına kadar devam eder. Ayrıca, kas liflerinin kaybı, ekson atlaması gibi RNA tamiri tedavisi bazlı tedavilere de müdahale ederek etkili olmalarını etkiler.
.
DMD'deki dejenerasyon ve renerasyon devrelerinin kesintiye uğratılması veya engellenmesi için, kas lif zarı içinde distrofin depolanmalıdır. Bu, bir kök hücre tedavisi ile sağlanabilir, donör hücreler ya normal bir bireyden (allograft) ya da hastanın kendisinden (autograft) alınır ve distrofin salmaları için yönetilir. DMD'yi müsküler distrofinin bir modeli olarak alacağız ve bunun kök hücre tedavisinde iyileştirici olabileceğine dair kanıtı kritik bir gözle inceleyeceğiz.
.
3. Donör hücrelerin rejenere edilmiş kas liflerine katkısı ve uydu hücre havuzunun yeniden oluşturulması
Belirli bir kök hücre tipinin distrofik kasların tedavisindeki faydasını değerlendirmek için, ya kas lifi markerlerinin ya da uydu hücrelerin donör orijinli olması gerekmektedir. Normal bir donörden distrofin eksikliği olan bir alıcıya hücre nakli esnasında, donör orijinli kas liflerinin en sarih markeri distrofindir. Ancak, DMD hastalarında ve DMD hayvan modellerinde eski haline dönüşebilen kas liflerinin mevcudiyeti, özellikle mdx faresinde, ki bunun eski haline dönüşebilen liflerinin sayısı yaşı ile birlikte artar, yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, kas lifinin gerçekten donör orijinli olduğunu teyit etmek için ikinci bir marker kullanılır. Genetik değişime uğramış 3F-nLacZ-E faresinden donör hücre naklederken, ki bunun kas lifi çekirdeği beta-galactosidaz salmaktadır, donör orijinin miyo-çekirdekleri beta-galactosidaz salmaktadır. Alternatif olarak, GFP gibi marker bir gen salan donör farelerden alınan hücreler veya bir marker gen ile retroviral işaretlenen hücreler, donör orijinli hücrelerin, kas lifleri de dahil olmak üzere, tespit edilmeleri için kullanılabilir. Ancak, genetik markerlerin sınırlamaları göz önünde bulundurulmalıdır, örneğin promoterler in vivo koşullarda devreden çıkabilirler veya donörden türetilen proteinler kendilerini oluşturan miyo-çekirdekten uzaklaşarak bir birden fazla çekirdekli lif boyunca yayılabilirler.
.
İnsan hücrelerini alıcı farelere naklederken, donör orijinli kas liflerinin tespit edilmesi için insana özgü distrofin veya spektrin antikorları kullanılabilir; ve insan çekirdeklerini tespit edip farelerinkini tespit etmeyen antikorlar (örneğin insan lamin a/c) kas liflerinin gerçekten insan orijinli olduğunun teyidi için kullanılabilir.
.
Myf5nLacZl+ faresi, donör fare hücrelerinin uydu hücre oluşturup oluşturmadığının tespiti için kullanılmıştır, ama insan orijinli hücreler durumunda insana özgü bir antikor (örneğin insan lamin a/c) bir uydu hücreye özgü antikor (örneğin Pax7) ile kombine edilmek zorundadır.
.
DMD gibi kronik bir durumun tedavisi için, büyük miktarlarda kas oluşturmanın yanı sıra fonksiyonel uydu hücrelere katkıda bulunmak da gereklidir. İlk hücre kök uygulamasından sonra distrofinin vücudun her bir kasındaki her bir lifin uzunluğu boyunca yayılmaması halinde, ne bütün liflerin ne de liflerin distrofin-negatif bölümlerinin gelecekte nekroza maruz kalması mümkün görünmemektedir. Fonksiyonel donörden türetilmiş uydu hücreler, ömür boyu kas liflerini tamir etmeli ve yenilemelidir; oysa normal bireylerde dahi bu prosesler zamanla etkisini kaybetmekte ve ilerleyen yaşlarda sarkopeniye neden olmaktadır. Her ne kadar birçok kök hücre transplantasyondan sonra en azından birkaç uydu hücre üretmiş olsa da, bazı araştırmalarda bu uydu hücrelerin fazla miktarda olmadıkları, veya fonksiyonel olmadıkları ve hatta bazılarının gerçekten fonksiyonel olmadıkları açıkça görülmüştür. DMD'li fare modellerine nakledilen hücrelerin fonksiyonel kas kök hücresi olup olmadığını kontrol etmek için, hücreler nakledilir, rejenerasyona katkıda bulunmaları için zaman tanınır ve sonra nakledilen bu hücreler kas liflerini tahrip edecek, ama endojen kök hücrelerine zarar vermeyecek bir şekilde yaralanır (örneğin, yılan zehri notexin enjekte ederek). Yaralamadan bir hafta sonra donör orijinli yeni üretilmiş kas lifleri bulgusu, başlangıçta nakledilen hücrelerin en azından bazılarının gerçekten fonksiyonel kas kök hücresi olduğunun, bunları kasın tahribatından sonra yeniden kas lifi üretebileceklerinin kanıtıdır. Ama, donör orijinli bu kok hücrelerin, uzun vadeli etkili olmaları için, alıcı hücre içinde tutulabiliyorlarsa ve kas rejenerasyonuna katkıda bulunuyorlarsa, uydu hücre olmalarına gerek yoktur.
.
4. Heterolog hücreler yerine otolog hücrelerin kullanılması
DMD'nin tedavisi için, normal donörlerden türetilen kök hücreler distrofin salan kas liflerinin oluşmasına yol açacaktır, ama tedaviye maruz kalan hastaların donör kas liflerini immünolojik bağlamda reddetmemeleri için immüno-supresyona ihtiyaçları olabilecektir. Açıkça görüldüğü gibi otolog hücreler, her ne kadar kas rejenerasyonuna katkıda bulunup immünolojik redde yol açmadan uydu hücre havuzunu yeniden oluştursa da, distrofin eksikliğini gidermemektedir. Hastaların tedavi edilmesi için, ya bir mini-distrofin geni veya mutasyona uğramış distrofin eksonlarını atlamak için tasarlanmış bir gen ile genetik değişime uğratılmış otolog hücreler kullanarak daha kısa, ama hala fonksiyonel olan distrofin oluşturulması gerekmektedir.
.
Lentivirüsler, kök hücrelere gen uygulamak için idealdir, çünkü bunlar post-mitotik veya pasif hücreleri enfekte ederler ve alıcı genom içerisinde entegre hale gelirler, bunun sonucunda hem in vitro hem de in vivo koşullarda sabit uzun vadeli gen salarlar. Ama gen insörtlerini büyüklükleri göreceli küçük olduğundan ve alıcı genomda insörte bağlı mutagenesis olabileceğinden dolayı dezavantajlıdır. Yani, uygun bir promoter bularak söz konusu genin sadece kas liflerinde devreye girmesini ve in vivo koşullarda uzun vadeli salınmasının temin edilmesi temel önem taşımaktadır.
.
Viral vektörlere ilave olarak, son zamanlarda geliştirilmiş olan viral olmayan vektörler, örneğin transposonlar ve suni insan kromozomları (HAClar), gelecekteki klinik uygulamalar için mümkün olabilecek alternatif gen nakil araçlarıdır. Transposon bazlı bir vektörün hem hedef genleri alıcı genoma stabil entegre etme kapasiteleri, hem de uzun süreyle hematopietik kök hücre, mesenkimal kök hücre, kas progenitör hücre ve iPS hücreleri gibi hücrelerde yüksek gen salım seviyeleri vardır; bu arada HAC'lar, insörtsiyonel mutasyonları engelleyen stabil bir episomal sağlamlığı sağlarlar ve ayrıca büyük gen insörtlerini, düzenleyici elementler de dahil olmak üzere, taşıma kapasitesine sahiptirler. HAC'ların tam uzunlukta distrofin geninin DMD hastalarından türetilen iPS hücrelerine sunulması için kullanıldığı rapor edilmiştir; HAC salan bir distrofin taşıyan otolog kas kök hücreleri DMD terapisi için gelecekte umut verici olabilir.
.
5. DMD tedavisi için ideal kök hücre
Teorik olarak kök hücreler, DMD'nin tedavisi için aşağıdaki kriterleri yerine getirmelidir:
1. in vitro koşullarda, kök hücre özellikleri kaybetmeden genişletilebilmelidir;
2. immün açıdan imtiyazlı olmalıdır;
3. vücuttaki iskelet kaslarının çoğunluğu etkileneceğinden, sistematik olarak nakledilebilir olmalıdır;
4. Her kasın maksimum alana ulaşması yerine, alıcı kasa ulaşmasının üzerine hayatta kalmalı, üremeli ve yer değiştirmelidir.
5. Ya hasarlı lifleri tamir etmek için veya kaybolan liflerin yerine konması için kas lifleri içinde farklılık göstermelidir.
6. Uydu hücre havuzunu fonksiyonel kök hücrelerle yeniden düzenlemelidir ki bir lif veya lifin bir bölümü nekroza uğrarsa distrofin üretebilen uydu hücreler lifi onarabilmek ve destekleyebilmek için mevcut durumda olsunlar.
7. Kasa bir kez verildikten sonra distrofin açığa çıkarabilmelidir.
8. Kas gücü artışına neden olmalıdır ki tedavi gören hastanın yaşam kalitesi de artış göstersin.
.
Uzun süredir kök veya öncü hücrelerin müsküler distrofileri tedavi edebilme olasılıkları olduğu düşünülmektedir. DMD’nin hem fare hem de köpek modellerinin varlığı, özellikle immün yetersizliği olan fare modelleri, eksojen kök hücrelerin test edilecek rejenere kas liflerine katkıda bulunmasına izin vermiştir. DMD tedavisindeki farklı kök hücrelerin avantajları ve dezavantajları Tablo 1’de özetlenmiştir ve açağıda ayrıntılı olarak tartışılmıştır.
.
5.1. Miyoblastlar
Pasif uydu hücreler verimli bir şekilde iskeler kas rejenere edebilir ve uydu hücre kompartımanını işlevsel bir şekilde yeniden düzenleyebilir. Ancak deneysel bir düzende aşılanabilmelerine rağmen, yeni izole edilmiş pasif donör uydu hücreler tedavi için elverişli olmayabilir. DMD tedavisinde kullanılmasına karar verilecek ilk hücre tipi bu sebeple miyoblasttır, uydu hücrelerin silsilesidir. Miyoblastlar kültür içinde genişletilebilir ve mdx farelere kas içi enjeksiyonla verilmesini takiben kas oluşturur ancak yeni izole edilmiş uydu hücrelerden çok daha az yeterli bir şekilde iskelet kas üretme gibi bazı dezavantajları vardır. İlave olarak, miyoblastlar sistematik olarak nakledilebilir görünmemektedirler ve bir kas içi enjeksiyon sonrasında dahi yer değiştirme kapasiteleri sınırlıdır. Miyoblastların bir enjeksiyon alanından iskelet kas içine doğru yer değiştirmesini geliştirmek için teşebbüslerde bulunulmuşsa da hiçbiri tam olarak başarılı olamamıştır. DMD tedavisinde kullanılan miyoblastların klinik denemeleri umutları boşa çıkaracak yöndeydi ve yakın zamandaki ümit vaat eden verilerin aksine müsküler distrofilerin tedavisi için miyoblastlara olan ilgi azaldı.
.
5.2. İskelet kas içindeki diğer kök hücreler
Kas içinde uydu hücreler dışında kastan elde edilen kök hücreler, kas yan popülasyon hücreleri, miyojenik endotelyal hücreler gibi kas rejenerasyonuna katkısı olabilecek kök hücreler de mevcuttur, ancak bu hücrelerin kaynağı ve isabetli idantitesi ve normal sağlıklı kaslar içinde kas kök hücreleri olarak ne boyutta davrandıkları netlik kazanmamıştır. İskelet kaslara sistematik olarak nakledilebilen en çok ümit vaat eden hücreler mezoanjiyoblastlar (veya perisitler) ve CD133 kök hücre markörünü etkileyen kastan alınan hücrelerdir. Mezoanjiyoblastlar ve perisitler sırasıyla embriyonik veya postnatal evrelerden kan damarlarıyla ilgili kök hücrelerdir. Bu hücrelerin kas rejenerasyonu için yeterli olup olmadıkları distrofik fareler (a-sarkoglikan sıfır fare ve SCID-mdx fare) ve köpekler üzerinde fareden, köpekten ve insandan alınan hücreler kullanılarak test edilmiştir. Donör perisitlerin, sınırlı da olsa, sistematik nakil sonrasında uydu hücre havuzu oluşturabileceğine dair sanıtlar vardır, ancak perisit kompartımanını oluşturup oluştumadıkları netlike kazanmamıştır. Gözlemlenen ümit verici transplantasyon verimliliğine dayanarak, insan mezoanjiyoblast transplantasyonu üzerindeki I evresindeki klinik çalışmaların ileri planlama aşamasında olduğu söylenebilir..
.
İnsan CD 133 antijeninin glikosile epitopunu etkileyen ve iskelet kastan elde edilen AC133+ hücreleri, müsküler distrofilerin tedavisi için yine ümit vaat eden bir kök hücredir. Ancak, bu hücreler iskelet kas içindeki mononükleer hücrelerin çok küçük bir bölümünü etkilediğinden dolayı, saf AC 133+ hücrelerinin kastan izole edilmesinin teknik olarak güç olması ve sonrasında bunların kültür içine yayılması sebepleriyle uygulamalar sınırlıdır.
Kısa bir süre önce, in vitro iskelet ve düz kas silsilesi içinde farklılık gösteren ve intra müsküler transplantasyon sonrasında uydu hücrelerdeki ve PIClardaki artışa olduğu kadar iskelet kas rejenerasyonuna da katkıda bulunan, fare iskelet kasının interstisyel boşluğu içinde, interstisyel PW1+/Pax7– interstisyel hücreleri olarak adlandırılan bir hücre popülasyonu tanımlanmıştır. Ancak, sistematik nakil durumları henüz test edilmemiştir.
İskelet kas, bu sebeple, bir kas kök hücresinin tanımını karşıladığı görülen bir çok farklı hücre ihtiva eder, ancak, çalışma hücrelerinin saf popülasyonlarının hazırlanması oldukça zor olduğundan, bir hücre popülasyonunun başka bir kök hücre tipini ihtiva edebilmesi muhtemeldir.
.
Tablo 1
İskelet kas rejenerasyonuna katkısı olan hücreler.
Hücre tipi ve kaynak doku
Avantajlar
Dezavantajlar
Referans
.
Uydu Hücre – İskelet Kas
Miyoblast – iskelet kas uydu hücreleri
Kastan elde edilen kök hücreler –iskelet kas
Miyoendotelyal hücreler – iskelet kas kan damarları
Mezoanjiyoblast – kan damarları
Perisitler – iskelet kas kan damarları
AC133+ hücreleri – kan veya iskelet kas
PW1+/Pax7 – interstisyel hücreler (PIClar) iskelet kas
Kemik iliği ve kandan elde edilen kök hücreler
Mezenkimal kök hücreler – tüm organlar
ES hücreleri – embriyo iPS hücreleri - fibroblastlar
.
İn vivo intra müsküler enjeksiyon sonrası kas rejenerasyonuna katkıda bulunur. İşlevsel uydu hücrelerine katkıda bulunur. Rölatif saflıkla izole edilebilir.
.
İn vitro izole etmek ve yaymak kolaydır. İn vivo intra müsküler enjeksiyon sonrası kas rejenerasyonuna katkıda bulunur. İşlevsel uydu hücrelerine katkıda bulunur.
.
İn vitro yaymak kolaydır. İn vivo intra müsküler enjeksiyon sonrası kas rejenerasyonuna katkıda bulunur.
.
İn vitro yaymak kolaydır.
İn vivo intra müsküler enjeksiyon sonrası kas rejenerasyonuna katkıda bulunur.
İn vitro yaymak kolaydır.
İn vivo intra arteriyel enjeksiyon sonrası kas rejenerasyonuna katkıda bulunur.
Sınırlı bir seviyede uydu hücre havuzu oluşturur
Distrofik fare ve köpek modeller üzerinde test edilmiştir
Fare modellerde intra arteriyel enjeksiyon sonrası kas rejenerasyonuna katkıda bulunur
Sınırlı bir seviyede uydu hücre havuzu oluşturur
Fare modellerde intra müsküler enjeksiyon sonrası kas rejenerasyonuna katkıda bulunur
Uydu hücre ve PIC havuzlarına katkıda bulunur
İzole etmesi kolaydır
İyi karakterize edilir
Sistematik olarak nakledilebilir
Çoğu organdan izole edilebilir.
İn vitro yaymak kolaydır.
Multipotent
Pluripotent
İn vitro yaymak kolaydır.
İn vivo kas rejenerasyonuna katkıda bulunur.
Kastan elde edilen miktar çok az sayıdadır.
Yalnızca alınır almaz izole edilmesi durumunda kas rejenerasyonuna verimli bir şekilde katkıda bulunur.
Sistematik olarak nakledilemez.
İnsan uydu hücreleri in vivo test edilmemiştir.
Kas rejenerasyonuna ve uydu hücrelere olan katkısı uydu hücrelerden daha az yeterlidir.
Sistematik olarak nakledilemez.
Kaynağı bilinmez.
Uydu hücre oluşturduklarına dair kanıt yoktur.
Sistematik olarak nakledilemez.
İnsan mdscleri in vivo test edilmemiştir.
Uydu hücre oluşturduklarına dair kanıt yoktur.
Sistematik olarak nakledilemez.
Saf hücre popülasyonu hazırlamak zordur.
Saf hücre popülasyonu hazırlamak zordur.
Farklı hücre hazırlıkları arasında rejeneratif yeterlilik farklılıkları vardır.
Saf hücre popülasyonu hazırlamak zordur.
İn vitro yaymak zordur.
Kastan elde edilen AC133+ hücreleri rejenerasyona katkıda bulunma aşamasında kandan elde edilen hücrelerden daha verimlidir.
Saf hücre popülasyonu hazırlamak zordur.
İnsan PICları araştırılmamıştır.
Sistematik nakil test edilmemiştir.
İskelet kas rejenerasyonuna çok sınırlı bir ölçüde katkıda bulunur
Kemik iliğinden elde edilen miyoçekirdek ve uydu hücreleri tam işlevsel olmayabilir.
İskelet kas rejenerasyonuna çok sınırlı bir ölçüde katkıda bulunur
ES hücrelerinin kullanılması etik sorunlar doğurur.
Transplantasyon öncesinde kas silsilesi farklılıklarının azaltılması için uyarılmalıdır.
Tümör oluşumu ihtimali vardır.
Sistematik nakil test edilmemiştir.
.
5.3. Kemik iliği ve kandan elde edilen kök hücreler
İskelet kastan (bunun için kas biyopsisi gereklidir) daha kolay erişilebilen ve ne distrofik kas yapısından deleteriyöz etkilenmiş ne de sürekli kas rejenerasyonu döngülerinden dolayı tükenmiş bir kök hücre müsküler distrofilerin tedavisi için ideal olabilir. Kemik iliğine veya kandan elde edilen kök hücrelere olan erişim oldukça kolaydır ve çoğunlukla iyi karakterize edilirler. Çok hassas markörler kullanan original yayınların fare modellere uygulanan transplantasyonun kas liflerinde artış sağladığını göstermiş olmalarına rağmen, kas miktarı oldukça azdı ve donör çekirdek ihtiva eden kas lifleri distrofin veya a-sarkoglikan gibi kasa özel proteinleri etkilemeyebilir. Ayrıca, kemik iliğinden elde edilen kök hücreler uydu hücre pozisyonundaki hücrelerde artış sağlayabilmesine rağmen, hepsi işlevsel uydu hücreler olmayabilir.
.
5.4. Diğer kaynaklardan alınan mezenkimal kök hücreler
Sinoviyal membrane gibi kas olmayan dokulardan elde edilen mezenkimal kök hücreler, kas liflerinin rejenerasyonunda artışı sağlar ancak bu artışlar kayda değer değildir. MyoD kas düzenleyici faktörün etkilenmesiyle gücü azaltılan dermal fibroblastlar veya deri fibroblastları gibi fibroblastlar dahi düşük verimlilikte de olsalar fare modellerde kas liflerinin rejenerasyonunu sağlar. Ancak kas rejenerasyonuna belirgin bir katkıda bulunmasalar bile, mezenkimal hücreler yine de ekstrasellüler gözelerarası maddesi molekülleri üreterek veya DMD enflamasyonunu azaltarak terapötik etkilere sahip olabilir.
.
5.5. Pluripotent kök hücreler
Embriyonik kök (ES) hücreler gibi pluripotent kök hücrelerin kas rejenerasyonuna olan katkısı yakın zamanlarda ilgi toplamaya başlamıştır. Bunların kas rejenerasyonu için kullanılmasındaki temel sorun tümör oluşturmayan hücreler için seçilmek ve yüksek oranda miyojenik alt popülasyonlardır. Ancak yine de, transplantasyon öncesinde iskelet kası silsilesinin farklılıklarını azaltmak için uyarılan ES hücreleri hayatta kalmış ve denek farelerde intramüsküler aşılama sonrasında tümöre yol açmamışlardır. Pax3’ün uyarılmasının seçilen bir PDGFaR+/Flk-hücre popülasyonuyla kombine edilmesi yoluyla fare ES hücrelerinin fare modeller üzerinde tümör oluşumu yaşanmaksızın kas oluşumuna katkı sağladığı rapor edilmiştir. İnsan ES hücrelerinin kullanılması etik nedenlerden ötürü engellenmiştir, ancak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerin yapılanmasıyla aşılmıştır. iPS hücreleri somatik hücrelerden üretilen yapay pluripotent kök hücrelerdir ve davranışları ES hücreleriyle oldukça benzerlik gösterir. iPS’nin uydu hücremsi alt fraksiyonunun iskelet kası rejenerasyonuna katkısı rapor edilmiştir, ancak ne c-met ne de M-cathedrin olan uydu hücreler üzerinde tanımlanamayan bir hücre yüzey antijeni gösteren uydumsu hücrelerin seçiminde kullanılan SM/C2.6 antikoru ticari şekilde mevcut olmadığından dolayı bu deneylerin tekrarlanması güçtür.
.
6. DMD için kök hücrelerin preklinik test edilmesi
Kimi kök hücreler DMD’nin tedavisi için ümit vaat ediyor olsa da, yukarıda ayrıntıları verilmiş olan gerekliliklerin tümünü sağladığı farklı laboratuarlarca değerlendirilmiş olan hiçbir hücre yoktur. Farklı araştırma grupları hücrelerin hazırlanması ve korunması için farklı protokoller kullanır ve elde ettikleri verileri analiz etmek ve ölçmek için farklı hayvan modelleri ve yöntemler kullanır. Bu durum da farklı laboratuarlar tarafından gerçekleştirilmiş işlerin kıyaslanmasını imkânsız kılar. Örneğin, insan sinoviyal kök hücrelerinin immün yetersizliği olan denek fare üzerinde kas rejenerasyonuna katkıda bulunabildiğinin gösterilebilmesine rağmen, bu bulgular başka bir grup tarafından tekrarlanamamıştır. Ancak, iki çalışma arasında, farklı konak hücreler, farklı denek fareler ve aşılama öncesinde üzerinde çalışılacak kasa hasar vermek için kullanılan farklı yöntemler gibi bu çelişkilere yol açabilecek bir çok farklılık vardır. Sorunları aşabilmek için, farklı laboratuarlar arasında standart işletim prosedürleri belirlenmelidir ve hücrelerin tutarlı ve tekrarlanabilir tanımlanmalarını, hazırlanmalarını ve saflaştırılmalarını ve in vitro yayılımda kök hücre karakteristiklerinin korunabilmesini ve in vivo kas rejeneratif kapasitelerinin analizini mümkün kılabilmek için bilimsel çevrelere bildirilmelidir. İdeal olan, bir laboratuar tarafından hazırlanan hücrelerin başka bir laboratuar tarafından test edilmesi ve aynı sonuçların farklı ellerden sağlanabileceğinin ispat edilebilmesi için aşılanmış kasların kontrol ve analizinin yine farklı ellerden yapılmasıdır. En hassas test işlemi ise, iki farklı laboratuarın birbirlerinden bağımsız olarak bir tip kök hücre (örn. Kastan elde edilen AC133+ hücreleri) hazırlayıp yayması ve her laboratuarın, örneğin intra arteriyel enjeksiyonu takiben, tüm hücre tiplerini ve birbirlerinin tercih ettiklerini fare soyunu (örn. Mdx SCID’ye nazaran mdx nu/nu) kendilerinin test etmesidir. İstatistiksel belirginliğin sağlanabilmesi için her iki laboratuar tarafından her soydan en az 6 fare her iki hücre tipiyle de aşılanmalıdır. Sonrasında her laboratuar her aşılı kasın yarısını diğerlerini göz önünde bulundurmaksızın donör kaynağının kas liflerini tespit etmek için aynı antikorları kullanarak analiz etmelidir. Bu gibi bir prosedür özellikle bir kök hücrenin hazırlanmasının terapötik amaçlar için daha fazla incelemeye değer olup olmadığının kararını verecektir.
.
Dayanıklı bir kök hücre farklı kas patolojilerine (örn. Enflamasyon, fibroz, kas lifi nekrozu, sürmekte olan rejenerasyon) sahip farklı distrofik hayvan modelleri üzerinde işlevsel olmalıdır ki insan kasları üzerinde de işlevsel olma ihtimali bulunsun. Ancak, alıcı kasın patolojik miliyösü gibi denek farenin immünolojik durumundaki farklılıkların da donör kas kök hücresinde aşırı etkileri olabileceği akıldan çıkarılmamalıdır.
.
Tercih edilen kök hücre tanımlanınca, GMP koşullarında çıkarılmalı ve yayılmalı, hücre belirleyici markörlerle karakterize edilmeli, güvenlik için test edilmeli ve işlevini muhafaza edecek şekilde kriyoprezerve edilmelidir.
.
Özel bir hücre hazırlanmasının verimliliğinin preklinik testinde kullanılacak hayvanın da belirlenmesi gerekir. Mdx farelere aşılanan fare hücrelerinden alınan veriler ne kadar ilişkilidir? İnsan hücrelerinin immün yetersizliği olan mdx farelere aşılanması daha mı fazla bilgi sağlayacaktır? Veya daha büyük bir hayvan modeli mi kullanılmalıdır? Ve “başarılı” bir hücre hazırlığı nasıl tanımlanmalıdır? İsteğe bağlı olarak, aşağı yönlü kas liflerinin %30-50’sinin distrofin pozitif olduğu düşünülebilir ve hasarlanma sonrasında en az donör kas lifleriyle aynı miktarda rejenerasyon sağlama yeterliliğine sahip donör kaynaklı uydu hücreler, donör hücrenin klinik bir denemeye hazırlanması işlemi için uygun olabilir. Ancak, şimdiye kadar hiçbir laboratuar böyle sonuçlar ortaya koymamıştır.
.
Yukarıda özetlenen soruların en azından bir kısmına cevap verebilmek için, DMD tedavisi için insane kök hücrelerinin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmek için bir klinik deneme planlanmaktadır. Şimdiye dek uygulanmış olan sınırlı çalışmalar them intramüsküler miyoblast enjeksiyonunun –tartışmalı olsa da- hem de kastan elde edilen AC133+ hücrelerinin güvenli olduğunu göstermektedir, ancak halen DMD tedavisi için sistematik olarak nakledilen kök hücrelerle ilgili bir deneme yoktur.
.
Kimi gruplar sistematik olarak yönetildiğinde işleyecek ideal kök hücre gibi bir kutsal kaseyi ararken, ya doğrudan enjeksiyon sonrasında ayrı vital kasların tedavisini veya alıcı kas yapısının lif sağkalımını veya endojenöz kök hücre işlevini arttırmak üzere geliştirilmesini gerçekleştirebilen bir kök hücrenin izolasyonu halen daha kazançlı olabilir.
.
Hangi strateji veya hücre kullanılırsa kullanılsın, herhangi bir klinik denemeye dikkatlice karar verilmeli ve yalnızca çok titiz preklinik deneyler yinelenebilir etkinlik kanıtları sağlayabiliyorsa uygulamaya geçilmelidir.
.
